Biserica Mănăstirii Humor îşi are începuturile în vremea domniei lui Alexandru cel Bun, când se ridica cea dintâi aşezare mănăstirească, ctitoria marelui vornic Ioan (1415).
La începutul secolului al XVI, în anul 1527, mănăstirea a fost jefuită şi distrusă de tătari, ruinele ei existând şi astăzi în vecinătatea actualei biserici.
În vremea lui Petru Rareş, Mănăstirea Humor intră în campania de restaurări iniţiată de domnitor, lucrare săvârşită de logofătul Toader Bubuiog care a zidit biserica cu „cheltuiala şi osteneala” lui şi a soţiei sale, Anastasia. În anul 1530, pe 15 august, are loc sfinţirea bisericii, zi care va deveni şi hramul mănăstirii. În 1641 zidurile înconjurătoare sunt întărite şi se construieşte turnul de apărare de către domnitorul Vasile Lupu.
Din punct de vedere arhitectural biserica Humor se evidenţiază prin câteva elemente: lipsa turlei ca şi în cazul altor ctitorii boiereşti, pridvorul deschis cu arcade precum şi tainiţa situată deasupra gropniţei unde în vremuri de restrişte se păstrau obiectele de preţ.
Biserica mănăstirii Humor se numără, alături de bisericile de la Voroneţ, Moldoviţa, Suceviţa şi Arbore, printre cele cinci ctitorii împodobite atât la interior cât şi la exterior cu fresce bizantine care le fac unice în lumea ortodoxă. Fresca exterioară de la Humor este pictată de „Toma, zugrav de Suceava”, la 1535.
În pronaos picturile înfăţişează Sinaxarul (calendarul bisericesc), icoana Adormirii Maicii Domnului şi a Sfintei Fecioare rugătoare, îngeri şi profeţi. În camera mormintelor bolta este acoperită cu scene din viaţa Sfintei Fecioare Maria. În naos sunt pictate chipuri de sfinţi, ciclul Patimilor şi Învierea, iar pe boltă Hristos Pantocrator. Tot în naos sunt tablourile ctitorilor. În altar, pe bolta absidei, este reprezentată, tradiţional, Maica Domnului cu Pruncul, alături de chipuri de sfinţi ierarhi şi Cina cea de taină. Pictura este caracterizată prin unitate de tonalitate cromatică, predominând nuanţe de roşu-purpuriu, brun-roşcat, roşu-violet şi altele.
Ceea ce impresionează cel mai mult sunt frescele exterioare. Expus intemperiilor, peretele nordic se resimte cel mai mult. Restul picturii oferă ochiului o sublimă orchestraţie de culori. Heruvimi, serafimi, îngeri, profeţi, apostoli, ierarhi alcătuiesc tema Cinului. Imnul Acatist al Bunei Vestiri este zugrăvit pe peretele de sud. Tot pe peretele sudic se află şi Asediul Constantinopolului reflectând evenimentele din 1453 care au dus la ocuparea capitalei Imperiului Bizantin de către turci. La intrarea în biserică ne întâmpină scena Judecăţii de Apoi unde apar multe elemente de factură locală: buciumul, laviţa, cobza, ştergarul.
Biserica a fost înzestrată cu obiecte preţioase şi manuscrise, dintre care cel mai de preţ şi care se păstrează şi astăzi este Tetraevan-gheliarul din 1473 cu celebra miniatură a domnitorului Ştefan cel Mare care se păstrează în muzeul Mănăstirii Putna, carte dăruită de domnitor.
Se păstrează şi iconostasul, 4 icoane din secolul al XVI-lea, un jilţ şi strane din aceeaşi perioadă.
În 1785 Bucovina a fost anexată Imperiului Habsburgic, iar biserica mănăstirii Humor a devenit biserica satului până în anul 1991 când şi-a recăpătat statutul de mănăstire, obştea fiind alcătuită din maici.